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        您的細胞準備好“開學”了嗎?

        發布時間: 2022-02-28  點擊次數: 771次
        各位老師在進行細胞培養時,肯定會遇到以下問題:
        • 細胞越長越多
        • 買的細胞比較貴重
        • 節假日無法照看細胞
        • 實驗不順暢需要重新進行實驗


        這時,我們就需要適當的保存一些細胞,也就是凍存細胞。


        細胞凍存是細胞保存的主要方法之一。

        利用凍存技術將細胞置于-196℃液氮中低溫保存,可以使細胞暫時脫離生長狀態而將其細胞特性保存起來,這樣在需要的時候再復蘇細胞用于實驗。而且適度地保存一定量的細胞,可以防止因正在培養的細胞被污染或其他意外事件而使細胞丟種,起到了細胞保種的作用。

        在不加任何保護劑的條件下直接凍存細胞時,細胞內和外環境中的水都會形成冰晶,能導致細胞內發生機械損傷、電解質升高、滲透壓改變、脫水、pH改變、蛋白變性等,能引起細胞死亡。



        如向培養液加入保護劑,可使冰點降低。在緩慢的凍結條件下,能使細胞內水份在凍結前透出細胞。貯存在-130℃以下的低溫中能減少冰晶的形成。細胞復蘇時速度要快,使之迅速通過細胞最易受損的-5~0℃,細胞仍能生長,活力受損不大。目前常用的保護劑為二甲亞砜(DMSO)和甘油,它們對細胞無毒性,分子量小,溶解度大,易穿透細胞。


        放假前大家進行細胞凍存,安心過個好年,那么接下來


        您的細胞準備好“開學"了嗎?


        細胞凍存復蘇遵循的原則是:慢凍快融


        今天我們來聊聊,細胞復蘇時需要注意的那些事兒。
        細胞復蘇的原則:快速融化
        必須將凍存在-196℃液氮中的細胞快速融化至37℃,使細胞外凍存時的冰晶迅速融化,避免冰晶緩慢融化時進入細胞形成再結晶,對細胞造成損害。


        01

        實驗前準備


        1. 將水浴鍋提前預熱至37℃

        2. 細胞實驗室進行常規消毒,用75%酒精擦拭紫外線照射40min的超凈工作臺臺面,保證無菌。

        3. 在超凈工作臺中按次序擺放好消過毒的離心管、吸管、培養瓶等即將使用的耗材及試劑。

        02

        取出凍存管

        1. 根據細胞凍存記錄按標簽找到所需細胞的對應編號。

        2. 從液氮罐中取出細胞盒,取出所需的細胞,同時核對管外的編號。

        03

        迅速解凍

        1. 迅速將凍存管投入到已經預熱的水浴鍋中迅速解凍,并要不斷的搖動,使管中的液體迅速融化。

        2. 約1-2min后凍存管內液體*溶解,取出用酒精棉球擦拭凍存管的外壁,再拿入超凈臺內。

        04

        平衡離心

        用架盤天平平衡后,放入離心機中3000r/min?離心3分鐘。

        05

        制備細胞懸液

        1. 吸棄上清液。

        2. 向離心管內加入10ml*培養液,吹打制成細胞懸液。

        3. 用培養液懸液混懸沉淀細胞,調整細胞濃度,放入培養箱中培養。

        06

        細胞計數

        細胞濃度以5×105/ml為宜。

        07

        培養細胞

        將復合細胞計數要求的細胞懸液分裝入培養瓶內,將培養瓶放入37℃,5%CO2的培養箱內2-4h(或者24-48h)后換液繼續培養培養,換液的時間根據細胞情況而定。

        08

        記錄復蘇日期


        “ Note

        注意事項



        細胞凍存和復蘇是細胞培養技術里面最容易出現問題的部分,因此我們幫您總結以下幾點注意事項,幫助您更好的進行實驗操作:

        1. 注意無菌操作。
        2. 取細胞的過程中可能會接觸液氮,一定注意帶好防凍手套,護目鏡。
        3. ☆此項尤為重要,如果凍存管密封不嚴,細胞凍存管可能漏入液氮,解凍時,在水浴中搖晃,凍存管中的氣溫急劇上升,可導致爆炸,所以,一定要戴保護眼鏡和手套。
        4. 應在1-2min內使凍存液*融化。如果復溫速度太慢,則會造成細胞損傷。另外,細胞復蘇后的操作最好在4℃冰浴中進行,以減少冷凍保護劑對細胞的毒性。
        5. 細胞復蘇過程中,升溫的速率要大,把從液氮或-70℃水箱中取出的細胞在最短的時間內放入水浴鍋中進行解凍。
        6. 離心前須加入少量培養液。細胞解凍后二甲基亞砜濃度較高,注意加入少量培養液可稀釋其濃度,以減少其對細胞的損傷。
        7. 細胞貼壁少的問題:教科書中說明凍存細胞解凍時1ml細胞液要加10ml-15ml培養液,經驗總結,培養基越少細胞越容易貼附。
        8. 復蘇細胞分裝的問題:復蘇1管細胞一般根據情況可分裝到1-2只培養瓶中,分裝過多,細胞濃度過低,不利于細胞的貼壁。
        9. 加培養基的量放入問題:這個量的多少的把握主要涉及到的問題是DMSO的濃度,從如果加培養基的太少,DMSO的濃度就會比較大,就會影響細胞生長,從以前的資料來看,DMSO的濃度在小于0.5%的時候對一般細胞沒有什么影響。還有一個說法是1%。所以如果凍存液的濃度是10%DMSO,那么加10ml以上的培養基就恰好稀釋到了無害濃度。  


         初學者易犯錯誤 

        1. 水浴鍋未提前預熱或者未預熱到37℃直接融化。
        2. 水浴鍋內凍存管太多,導致傳熱不佳,使融化時間延長。
        3. 離心前忘記平衡,導致離心機損壞和細胞丟失。
        4. 一次復蘇細胞種類過多,忘記更換吸頭和吸管,導致細胞交叉污染。


        解凍后的細胞要用和以前一樣的培養液和血清。因為每一種細胞都有自己特定的,并且已經熟悉了的生長環境。突然使用不一樣的培養液和血清,會造成細胞生長不良,甚至死亡,像水土不服一樣。


        結果分析


        判斷細胞復蘇成功與否,需要看復蘇后細胞貼壁率及細胞存活率(細胞存活率將凍存管內剩余的細胞,用臺盼藍染色法檢測復蘇細胞的存活率。呈藍色的細胞為死細胞,活細胞不著色。用細胞計數板和計數器計數細胞,得出細胞存活率)。


        如果復蘇后95%以上的細胞貼壁,而且細胞的活性好,這就說明細胞復蘇的過程沒有問題。復蘇的細胞恢復到正常生長,達到正常的生長特性(比如細胞群體倍增時間等)后要再凍存以補充細胞儲存數量。


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